1.培养基准备：一般采用钩悬法进行多孢分离，从瓶口悬下一个“S”形铁丝钩。在三角瓶内准备好培养基，灭菌冷却后备用。
2.种菇选择：选择某一品种出菇早、朵形好、长势旺盛的子实体，从中选择菌盖完整、接近成熟、菌褶发育完好的单个子实体，去掉菌柄上黏附的杂质与泥土。
3.种菇消毒：在接种箱内或超净工作台上进行操作，用无菌水将菌盖冲洗干净，再用75%酒精将菌盖擦拭消毒。
4.孢子采集：在接种箱或无菌超净工作台上无菌操作。用小剪刀剪取2厘米见方的带菌肉的菌褶，用铁丝钩将之悬吊在三角瓶中，菌褶朝下，孢子弹射后直接落在三角瓶底部的培养基上。
5.菌丝培养：将处理好的三角瓶置于20～25℃恒温培养箱中，培养8～12小时，当孢子落到培养基上之后，及时在无菌条件下将铁丝钩及种块取出，然后放在25℃的恒温培养箱中继续培养，孢子在适宜的温度下开始萌发。正常情况下7天左右就会见到三角瓶内的培养基上形成大量的菌丝。当菌丝生长到一定量时，可转接到母种斜面上，试管上长好的菌丝即可作为母种。孢子分离获得的母种必须经过出菇试验后方能在生产上应用。
