1.采样与消毒
采芽的时间一般选在冬季,此时引起褐变的物质含量低,采芽的成活率高。不过,并非所有品种都可如此处理,有些品种在冬季是不长新芽的。采样时,选取新生假球茎(老球茎生长点多已停止发育,且易污染),把新茎从母株的着生部位切下,一边在流水中冲洗,一边从外侧按顺序剥除叶片,最后用锋利的刀将切口和脏物削掉。消毒剂可用酒精、漂白粉等。消毒时最好用有盖的瓶子,一边消毒,一边摇动,减少气泡附着。消毒完后,用无菌水冲洗材料数次,然后按无菌操作要求取芽。取芽应选茎中间部位的大芽,因为其成活率和生长率都比较高。取芽的方法有两种:一种为摘出法。先将芽切下,并将下面的切口切去少许,然后自上轻压,将芽压出,如此重复1～2次,就可得到0.5～1.0毫米的外植体(此法需小心、熟练,切口切得太长会切掉生长点,过短则挤不出);另一种方法是首先连苞叶进行同样的液体培养,之后除去苞叶,将仅附周围组织的生长点移到固体培养基上。后一种方法的成活率、萌芽率相对较高。外植体的大小,以脱毒为目的应为0.2～0.3毫米,以增殖为目的一般取0.4～0.6毫米以上,具体应根据卡特兰的类型而定。其中,blc系大型卡特兰茎尖可达1.5～2.0毫米,slc系小型卡特兰茎尖可取0.5～2.0毫米。
2.初代培养
初代培养时,可以选用的培养基有:ms+0.1毫克/升萘乙酸+10%椰乳+2%蔗糖,或ms+1毫克/升6苄基腺嘌呤+1.0毫克/升萘乙酸的固体培养基,或1/2ms(去除甘氨酸)+0.1～1.0毫克/升萘乙酸+0.1～1.0毫克/升6苄基腺嘌呤+2%蔗糖。基本培养基还可选nitsch、b5或卡特兰专用培养基等。天然有机物的添加,需根据具体情况经过实验确定。培养基的ph值以5.5～6.0为好。
将摘出的生长点移植到液体培养基静置培养,培养一周后更新培养液,3周后移至固体培养基。初代培养的温度以15～20℃成活率最高,成活后25℃有利于增殖。光照多用2000勒连续照明。
3.球茎的增殖和器官形成
通过初代培养的原球茎应尽早增殖为好。芽在培养基上培养2个月后,纵切4块,移至继代培养基中增殖,以后每隔一个月分割继代一次。虽然卡特兰可在液体静置培养中增殖,但质地比较疏松,时间太久还会使原球体死亡。
防止办法是液体培养与固体培养交替进行,交替时间以一个月左右效果较好。液体培养会抑制原球体分化芽,使原球体大量增殖,转至固体培养能使之生长健壮。在芽未分化时移到液体培养基,可使芽分化受到抑制,使原球体增殖。如此反复做液体和固体培养,可使原球体无限增殖。但长时间(约3年以上)的继代培养有可能产生变异株。因此,以生产与母株相似的幼苗为目的,其继代应是有限的。将固体培养基上形成的原球体块一个个分离转移到液体培养基时,切伤面应尽可能小。原球体增殖可使用如下培养基:ms(附录表11)+0.1～5.0毫克/升6苄基腺嘌呤+0.5～1.0毫克/升萘乙酸,或添加某些有机物如150克/升香蕉,150毫升/升椰乳。
当增殖到一定数量后,便可将原球体移到成苗培养基knudson+0.18毫克/升萘乙酸+0.02毫克/升激动素+0.175毫克/升赤霉素+30克/升蔗糖+6克/升琼脂上,经1～2个月,所有原球茎体便可生根成苗。分化芽的幼苗也可使用ms+0.1～1.0毫克/升激动素+1.0～5.0毫克/升萘乙酸,或ms+0.1～5.0毫克/升激动素+0.1毫克/升2,4二氯苯氧乙酸的培养基。
4.壮苗培养和试管苗出瓶
当苗长至15～25毫米时可转入壮苗培养基,以促进茎、叶和根的生长。壮苗培养基可用总离子浓度为30～35摩尔/升的基本培养基,加香蕉5%～10%。
出瓶苗可移入装有水苔或泥炭藓、珍珠盐、蛭石混合的培养土的营养钵中,适宜温度为15～25℃。此外,需进行遮光培养,夏季以遮光80%、冬季遮光50%为宜。