灵芝菌种的分别有组织分别、孢子分别及基质内菌丝分别三种方法。基质内菌丝分别因易污染较少选用。孢子分别法在研讨及菌株复壮时选用。规划出产时选用的是子实体菌丝分别法，该法操作简练，且能坚持原有菌株的优异性情。
（一）子实体菌丝分别法
选取形状发育正常、无病虫灾、未弹射孢子的灵芝子实体，菌盖边沿尚在生长的黄白色子实体，在无菌条件下用0.1%二氯化汞水溶液（升汞水）或75%酒精进行表面擦拭灭菌。切去菌柄基部，在菌盖中部，用单面刀片或解剖刀切取米粒大菌肉一块置入试管斜面培养基中心。可分别一些试管，以供挑选。试管置26~28℃恒温箱内，培养2~3日即可见菌肉上有少量白色棉絮状菌丝长出，7~8日后菌丝可长满斜面，选取灵芝菌丝生长旺盛、均匀、皎白的试管作为试验和出产用的菌种，一般称此为第一代母种试管，可保存在冰箱中供转管运用。
未构成菌盖的稚嫩菌柄亦可作为分别材料。
（二）孢子分别法
取发育正常、健旺、已初步弹射孢子的灵芝子实体。切除菌柄，无菌条件下用0.1%升汞水或75%酒精进行表面消毒，用无菌水次冲刷，再用无菌棉擦拭洁净。将菌管朝下放在经灭菌的培养皿内，外罩以用75%酒精擦拭过的玻璃罩，在25~30℃条件下通过5~6小时后孢子散落在培养皿底部，用接种针挑取少量孢子放入试管斜面培养基中部，移至培养箱中进行培养。分别用的培养基可选用一般马铃薯培养基、麸皮提取液培养基等。
孢子分别法污染率较高，应及时检查挑弃被杂菌污染的试管。待孢子萌宣告菌丝时，应连同少量培养基挑出及时移管。
可将子实体切成蚕豆大的种块，用无菌铁钩固定后置三角瓶中，瓶底有1cm后培养基，塞上棉塞。见孢子弹射后并萌宣告菌丝时及时移管。
野外分别灵芝孢子时因条件限制，可将菌肉（带菌管）贴在试管壁上，待孢子弹射入培养基后及时转管。
孢子萌发后先构成一级菌丝，几天后便可构成二级菌丝。如果在显微镜下观察到锁状联合，一般即可确定为得到了灵芝菌丝。
（三）基质内菌丝分别法
这是运用灵芝生长的基质作为分别材料获得灵芝菌种的一种方法。其利益是在灵芝子实体已变老时仍可以获得灵芝纯菌丝体。但是，在子实体生长时，基质内的灵芝菌丝体不是单独存在的，往往和细菌、放射菌、霉菌及其他真菌生长在一起。为获得纯灵芝菌丝体，分别时留心分别材料的挑选，选灵芝菌丝生长好，菇木没有腐朽的作为分别材料。分别时接种块尽可能小些，所分别的菌种要经出菇试验确认是优异菌株才可在出产上运用。